细胞因子风暴综合征可由各种治疗、癌症和病原体（包括 COVID-19）引发，COVID-19 诱导的细胞因子风暴在疾病的严重程度中起着核心作用，这表明病毒诱导的炎症反应决定了最严重的 COVID-19 症状。

研究表明，重症 COVID-19 患者的几种细胞因子增加，包括 IL-1β、IL-1RA、IL6、IL-7、IL8、IL9、IL10、FGF、GCSF、GMCSF、IFNγ、CXCL10、MCP1、MIP1A、MIP1B、PDGF、TNFα 和 VEGF。反过来，正在研究 IL-1β 和 IL-6 作为治疗 COVID-19 的潜在靶点。在 COVID-19 之外，细胞因子的产生已被证明可以确定许多其他病原体感染的严重程度，而生物样本中细胞因子的鉴定和量化可以阐明病毒诱导的免疫反应的复杂性。

用于细胞因子测量的最常见和便宜的方法是酶联免疫吸附测定 (ELISA)。然而，每个 ELISA 仅限于一种分析物，限制了可以同时测量的细胞因子总数。基于阵列的细胞因子测量可以同时测量多种细胞因子，但只能提供有关细胞因子存在/不存在的定性信息，并且需要专门的设备才能进行。

基于微球的多重流式细胞术检测遵循与 ELISA 类似的原理，但使用的是易于区分的微球，该测定允许同时评估多种细胞因子，以高检测灵敏度提供细胞因子浓度的准确定量，以及比传统方法更宽的动态范围。胞内细胞因子染色可以利用细胞表面标志物检测不同细胞类型产生的特定细胞因子。确定分泌的细胞因子的浓度以及产生细胞因子的细胞类型，能提供关于免疫细胞对刺激的反应的重要信息。

文章中使用两种免疫刺激剂，CD3 抗体或 LPS，用于激活来自两个供体的 PBMC。使用 BioLegend LEGENDplex COVID-19 细胞因子试剂盒测量了 27 种不同细胞因子。同时胞内染色与细胞表面标记相结合，以确定产生关键细胞因子 IL-2、IFN-γ 和 TNFα 的细胞群。在 Agilent NovoCyte Penteon 流式细胞仪上进行相关检测。


方案与结果
表 1. 流式检测设计方案


细胞内细胞因子的检测是少数无需分离纯细胞群即可鉴定产生细胞因子的细胞的检测方法之一。该方案是根据 NovoCyte Penteon 仪器配置设计，用于确定产生三种主要细胞因子（IL-2、IFNγ 和 TNFα）的细胞的百分比，并使用表面标记物识别 PBMC 中的主要细胞群：单核细胞、T 细胞、NK 细胞和 B 细胞。



图 1. 设门策略。PBMC 用 LPS 或者 CD3 刺激 15 个小时。之后按照表 1 的抗体进行流式染色。该图展示的是 CD3 刺激后的结果。



图 2. 左边使用 IgG 作为对照，右边使用 CD3 刺激。CD3 刺激后 T 细胞产能 IL-2、IFN-γ 和 TNFα 的能力大幅上升。



图 3. 单核细胞经 LPS 刺激后产生 TNFα 的能力有很大提升，进一步设门发现能产生 TNFα 的单核细胞表型主要是 CD14+CD16-这一群体。



图 4. 使用 LEGENDplexCOVID-19 细胞因子风暴试剂盒评估 PBMC 经由 LPS 或者 CD3 刺激后细胞上清中细胞因子变化情况。取样时间为刺激后 24 和 48 小时，该图展示的是其中一个样本刺激后 48 小时检测结果。纵坐标数值是刺激组和对照组浓度比值。某些超出最大检测浓度的细胞因子结果按照标曲最大值计算。



图 5. 使用 LEGENDplexCOVID-19 细胞因子风暴试剂盒评估 PBMC 中那些因子经由 LPS 或者 CD3 刺激变化明显。取样时间为刺激后 24 和 48 小时，该图展示的是其中一个样本刺激后 48 小时检测结果。A 展示的是受 CD3 刺激容易上调的细胞因子，Ｂ展示的是受 LPS 刺激上调幅度更大的细胞因子。

结论



基于流式细胞术的 LEGENDplex 检测可用于评估受新的生物制剂、治疗剂或病原体刺激细胞因子产生和免疫激活情况，样本可以是体液和生物样品。这些检测能对刺激后 T、B、NK 和单核细胞等产生细胞因子的能力进行深入分析，结果快捷且更客观。

LEGENDplex 检测与细胞内染色相结合时，可用于更深入地了解受刺激影响的细胞类型。结合这两种检测方法可以对免疫细胞活化进行详细评估。

*文章来源：安捷伦生物